【研究意义】氧化亚氮（N₂O）是一种高温室效应的气体，主要由农田土壤的硝化和反硝化过程产生，其增温潜势是CO₂的298倍，CH₄的20 ~ 30倍^[1]。我国水稻种植范围广，水稻土N₂O直接排放量占人为总排放量的11.4% ^[2]。因此，探明水稻土N₂O释放的影响因素及机制，符合国家“双碳”战略目标，可为稻田土壤N₂O科学减排提供理论依据。【前人研究进展】土壤水分是影响稻田土壤N₂O释放的关键因子，可以通过影响土壤氮循环微生物活性，进而影响土壤N₂O释放^[3-4]。在恒定水分条件下，Zhang等^[5]发现淹水土壤是N₂O释放的重要来源；Ma等^[6]研究表明水稻土N₂O释放量随着土壤含水量的升高而升高，当土壤含水量增至100%田间持水量（WHC）时，N₂O释放量达到峰值。在土壤水分干湿交替条件下，Ma等^[7]发现潮土干湿交替处理N₂O的释放主要集中在高含水量阶段。水稻土常为干湿交替的水分状况，水稻土中铁锰氧化物的氧化还原状态可随土壤水分干湿交替而变化，进而影响土壤氮素循环^[8-9]。水钠锰矿是土壤中常见的一类具有较强氧化性的锰氧化物，可与土壤氮素发生相互作用，进而影响土壤N₂O释放^[10]。Cavazos等^[11]发现水钠锰矿能够在3分钟内将80% ~ 100%的硝化中间产物羟胺（NH₂OH）氧化为N₂O。邢志强等^[12]发现水钠锰矿提高恒定含水量时红壤性水稻土N₂O释放速率。【本研究切入点】水钠锰矿是否会影响干湿交替的水稻土中N₂O的释放，尚需进一步探索。【拟解决的问题】本文通过设置不同的水分处理，添加水钠锰矿（0.1%，w/w），研究不同土壤水分状况下水钠锰矿对黄棕壤性水稻土N₂O释放的影响，阐明土壤水分干湿交替的环境中水钠锰矿影响黄棕壤性水稻土N₂O释放的机制，为减少水稻土N₂O释放提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   供试土壤理化性质

土壤为湖北省荆门市团林镇石龙村（30º51′ N，121º06′ E）的黄棕壤性水稻土，母质类型为第四纪沉积物（Q₃）。取0 ~ 20 cm的耕层土壤，去除明显的石砾、动植物残体等杂质并混合均匀后，室内避光通风处自然风干后过2 mm孔径的筛子，取一部分储存在4 ℃冰箱中用于培养实验，另一部分过1 mm孔径的筛子用于测定土壤基本理化性质。土壤pH 6.4、有机质37.3 g kg^–1、全氮1.8 g kg^–1、铵态氮24.6 mg kg^–1、硝态氮2.2 mg kg^–1、全锰675.5 mg kg^–1、HCl提取态锰83.1 mg kg^–1、全铁30.7 g kg^–1和HCl提取态铁3.1 g kg^–1。

1.2   水钠锰矿的制备

将166.7 ml 12 mol L^–1浓HCl匀速逐滴加入到煮沸的2.5 L 0.4 mol L^–1高锰酸钾溶液中，持续搅拌溶液，滴加结束后计时，保持沸腾10分钟，将得到的黑褐色沉淀离心并用去离子水反复洗涤至上清液电导率低于5 μs cm^–1，然后在60 ℃下老化12 h，得到钾含量9.5%，比表面积32 m² g^–1的水钠锰矿^[13]，将水钠锰矿研磨过0.149 mm的筛子，通过X射线衍射仪鉴定合成产物为水钠锰矿。

1.3   微宇宙培养试验

课题组前期研究表明土壤中添加0.1%质量比的水钠锰矿，可以增强红壤性水稻土N₂O的释放^[12]。基于此选择0.1%的质量百分比的水钠锰矿与土壤充分混合，同时设置不添加水钠锰矿（0%）的对照处理。将添加水钠锰矿的土壤样品（0.1%-Bir）与对照土壤样品（0%-Bir）分别放入19 cm × 27 cm培养盒中，调节土壤含水量为30% WHC，覆上透气膜，放入25 ℃恒温避光培养箱中预培养10天以恢复微生物活性。

预培养结束后，取相当于干重25 g的土壤于300 ml培养瓶中，以水溶液的形式将硫酸铵（N 100 mg kg^–1）加入土壤。试验周期为14d，为模拟水稻土不同水分状况，设置三种水分处理，分别为：60%WHC、100%WHC两种恒定水分处理以及100% ~ 60% WHC一种干湿交替水分处理。恒定水分处理中用去离子水调整土壤含水量；干湿交替水分处理中变化周期设置为：100% WHC（湿）-60% WHC（干）-100% WHC（湿）-60% WHC（干），即3天保持100% WHC阶段、1天通过40 g干燥硅胶干燥土壤和3 d保持60% WHC阶段，7 d为一周期，循环重复2次上述环节，土壤相对含水量变化趋势如图1所示。每个处理设置3个重复，于25 ℃恒温培养箱避光密闭培养。

图  1  100% ~ 60%WHC处理土壤相对含水量变化

Figure  1.  Soil moisture content changes in the 100% ~ 60%WHC treatment

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1.4   样品采集及测定

以土壤开始淹水时为0 d，在3、4、7、10和14 d分别用针筒采集培养瓶顶空气体作为气样，土样与气样同步采集，并通过质量法用去离子水调整含水量。采集的土壤样品一部分分析测定理化指标，另一部分保存在−80 ℃超低温冰箱中用以测定生物指标。使用气相色谱仪 （Agilent GC7890A） 分析气体样品中的N₂O含量，用去离子水浸提（水土比2.5∶1）pH计测定pH；采用高温外热重铬酸钾氧化－容量法测有机质含量^[14]；使用2 mol L^–1 KCl溶液浸提过滤后比色法测定NH₄ ⁺ 与NO₃⁻含量^[15]；采用硫酸铝浸提，高碘酸钾比色法测定Mn^{2 +} 含量^[14]；采用王水与高氯酸混酸消化土壤，电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定总锰含量；采用盐酸浸提，邻菲罗啉比色法测定土壤 Fe^{2 +} 和Fe^{3 +} 含量；添加盐酸羟胺，邻菲罗啉比色法测定总铁含量^[14]；田间持水量用重量法测定^[16]。

1.5   土壤DNA提取与定量PCR测定

使用HiPure Soil DNA Mini Kit试剂盒提取培养结束时的土壤样品的DNA，使用NanoDrop™ One（ND-ONE-W，Thermo Fisher Scientific，MA，USA）检测DNA浓度和纯度，于−20 ℃储存。

利用实时荧光定量PCR仪（CFX96，Bio-rad，USA），采用SYBRGreen染料法测定16S rDNA基因、氨氧化微生物（amoA）基因、亚硝酸还原酶（nirK）基因丰度和氧化亚氮还原酶（nosZ）基因丰度。实验中使用15 ul体系，包括7.5 ul 2 × SYBR Green Mix，0.7 ul上游引物，0.7 ul下游引物，1 ul DNA模板，5.1 ul DEPC水。各种功能基因所用引物如表1所示。

表  1  荧光定量 PCR 扩增引物

Table  1.  The primer information of RT-PCR

基因名称 Gene name	引物序列/5'-3' Primer sequence/5'-3'	参考文献 Reference
16S rDNA	F: GTGYCAGCMGCCGCGGTAA	[17]
	R: GGACTACNVGGGTWTCTAAT
AOA amoA	F: GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC	[18]
	R: GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG
AOB amoA	F: GGGGTTTCTACTGGTGGT	[19]
	R: CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
nirK	F: TCATGGTGCTGCCGCGYGANGG	[20]
	R: GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC
nosZ	F: GGGCTBGGGCCRTTGCA	[21]
	R: GAAGCGRTCCTTSGARAACTTG
注：F代表上游引物；R代表下游引物。W=A/T；K=G/T；S=G/C。

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1.6   数据分析

使用Excel 2010汇总计算数据、Origin 2019C绘图和PCA分析、IBM SPSS Statistics 21进行双因素方差分析和最小显著性差异法（LSD）进行差异性分析。

2.   结果与分析

2.1   土壤氧化亚氮累计释放量

如图2所示，从整个培养时期来看，N₂O累计释放量随着土壤含水量的增加而增加，60%WHC和100% WHC处理的N₂O累计释放量分别为118.5和9556.7 μg kg^–1；100% ~ 60% WHC交替处理的N₂O累计释放量为17513.3 μg kg^–1，显著高于60%WHC和100% WHC处理，说明干湿交替显著促进N₂O的释放。在培养时期内，水钠锰矿显著促进了恒定含水量条件（60%WHC和100% WHC处理）N₂O累计释放量（P < 0.05），增幅分别为11.3%和25.3%，但水钠锰矿对干湿交替水分条件（100% ~ 60% WHC处理）N₂O累计释放量影响不显著。

图  2  不同处理N₂O累计释放量（A）及100% ~ 60%WHC处理N₂O累计释放量的相对占比（B,C）

不同字母表示差异达5%为显著水平，下同。

Figure  2.  The cumulative N₂O emissions in different treatments (A) and the relative proportion of N₂O cumulative emissions in 100%-60% WHC treatment (B, C)

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培养14天内，100% ~ 60% WHC处理中的N₂O累计释放主要集中在100% WHC阶段，占总N₂O累计释放量的79.2% ~ 89.1%，100% WHC的水分条件利于黄棕壤性水稻土N₂O的释放。水钠锰矿能够显著促进第一个高含水量阶段（100% WHC）N₂O的累计释放，增幅为10.6%；但水钠锰矿显著抑制第二个高含水量阶段N₂O的累计释放，降幅为13.0%。

培养期内，黄棕壤性水稻土N₂O累计释放量与水钠锰矿有显著相关性（P < 0.05），与水分含量有极显著的相关性（P < 0.01），表明水分和水钠锰矿均影响黄棕壤性水稻土N₂O的释放，但干湿交替抑制水钠锰矿对黄棕壤性水稻土N₂O释放的促进效应。

2.2   土壤硝态氮与铵态氮含量

如图3所示，随着培养的进行，不同处理的NH₄ ⁺ 含量均在降低，NO₃⁻含量均在升高。培养结束时，60%WHC和100% ~ 60% WHC处理的NH₄ ⁺ 消耗量分别为106.6和114.9 mg kg^–1，显著高于100% WHC处理的NH₄ ⁺ 消耗量53 mg kg^–1。在培养时期内，100% ~ 60% WHC处理的低水分阶段（3 ~ 7d和10 ~ 14 d）中NH₄ ⁺ 消耗量高于第二个高水分阶段（7 ~ 10 d），结果表明60% WHC更利于NH₄ ⁺ 的消耗。水钠锰矿促进恒定水分处理的NH₄ ⁺ 消耗；抑制干湿交替处理的NH₄ ⁺ 累计消耗量，其中水钠锰矿提高干湿交替处理前7 d的NH₄ ⁺ 消耗量，降低10 ~ 14 d的NH₄ ⁺ 消耗量。

图  3  不同处理NH₄ ⁺ -N含量（A）和NO₃^--N含量（B）的变化

Figure  3.  Changes of NH₄ ⁺ -N (A) and NO₃^- -N contents (B) in different treatments

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培养结束时，60%WHC和100% ~ 60% WHC处理的NO₃⁻生成量分别为116.6和84.1 mg kg^–1，显著高于100% WHC处理的4.3 mg kg^–1，其中60% WHC处理的NO₃⁻生成量与其NH₄ ⁺ 消耗量相当，表明60% WHC下黄棕壤性水稻土中发生了NH₄ ⁺ 转化为NO₃⁻的硝化反应，比其他处理更明显。培养时期内，水钠锰矿促进了第二个高水分处理阶段的NH₄ ⁺ 消耗，降低了第二个高水分处理阶段的NO₃⁻生成，但水钠锰矿显著抑制第二个高含水量阶段N₂O的累计释放，表明干湿交替能够改变水钠锰矿对黄棕壤性水稻土无机氮转化的影响。

培养时期内，三种处理中净硝化速率由强到弱依次为60%WHC、100% ~ 60%WHC和100%WHC处理，大小分别为10.60 ± 0.04、7.65 ± 0.46和0.39 ± 0.29 mg kg^–1，结合2.1的结果表明60% WHC条件下土壤主要发生硝化反应，N₂O的累计释放量低；100% WHC条件下土壤发生了反硝化反应，N₂O的累计释放量高。净硝化速率与水钠锰矿加入无显著相关性（P > 0.05），而与水分含量有着极显著的相关性（P < 0.05），水分是影响硝化速率更为重要的因素。

2.3   土壤Mn^{2 +} 含量

如图4所示，随着培养的进行，所有处理的Mn^{2 +} 含量随着培养的进行而呈下降趋势。培养时期内，三种水分处理中的Mn^{2 +} 含量无显著变化。水钠锰矿加入后Mn^{2 +} 含量变化幅度增大，其中恒定水分条件下降幅小，为8.8% ~ 11.0%；干湿交替水分条件下降幅大，为72.4%，且集中在低水分阶段急剧下降，结果表明干湿交替能够显著影响水钠锰矿在黄棕壤性水稻土中的转化。

图  4  不同处理Mn^{2 +} 含量的变化

Figure  4.  Changes of Mn^{2 +} content in different treatments

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2.4   土壤微生物基因拷贝数

如图5所示，在培养时期内，随着含水量的增加，16S rDNA基因拷贝数增加，表明水分含量越高，黄棕壤性水稻土微生物数量增加。水钠锰矿显著提高了60% WHC处理的16S rDNA基因拷贝数，降低了100%WHC和100% ~ 60% WHC处理的16S rDNA基因拷贝数，表明水分含量的变化能够改变水钠锰矿对黄棕壤性水稻土中微生物的影响。

图  5  不同处理中AOA amoA、AOB amoA、nirK、nosZ、16S rDNA基因拷贝数（A, B, C, D, E）和nirK/nosZ的比值（F）

Figure  5.  AOA amoA, AOB amoA, nirK, nosZ, 16S rDNA gene copies (A, B, C, D, E) and the ratio of nirK to nosZ (F) in different treatments

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培养时期内，随着含水量的升高，土壤中amoA、nosZ和nirK基因拷贝数增多，而水钠锰矿对60% WHC处理的amoA、nosZ和nirK基因拷贝数没有显著影响，却显著降低了100%WHC和100% ~ 60% WHC处理的amoA、nosZ和nirK基因拷贝数，表明水分含量的升高抑制了水钠锰矿对黄棕壤性水稻土中氨氧化微生物与反硝化微生物的影响。

nosZ基因是唯一能将N₂O还原为N₂的酶^[22-23]，以nirK基因拷贝数与nosZ基因拷贝数的比值衡量反硝化微生物释放N₂O的主要驱动力^[24]，比值越高土壤反硝化微生物释放的N₂O越多。培养时期内，水钠锰矿显著提高了60%WHC和100% WHC处理的nirK/nosZ比，土壤反硝化微生物释放的N₂O增多；但水钠锰矿显著降低了100% ~ 60% WHC处理的nirK/nosZ比，土壤反硝化微生物释放的N₂O减少，表明干湿交替会降低水钠锰矿对黄棕壤性水稻土N₂O反硝化微生物释放N₂O的促进效应。

2.5   主成分分析

如图6主成分分析结果显示黄棕壤性水稻土中N₂O累计释放量与土壤理化性质及微生物活性之间的相关性，结果表明N₂O累计释放量与16S rDNA、amoA、nosZ、nirK基因拷贝数和Mn^{2 +} 含量具有正相关性。培养时期内，60% WHC处理及添加水钠锰矿后在主成分上变化很小；但100%WHC和100% ~ 60% WHC处理及添加水钠锰矿后在主成分上变化很大，表明含水量是影响黄棕壤性水稻土N₂O释放更为重要的因素。

图  6  主成分分析结果

N₂O 为氧化亚氮累计释放量，Mn^{2 +} 为二价锰离子含量，NN 为净硝化速率。

Figure  6.  Principal component analysis results

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3.   讨论

培养周期内，黄棕壤性水稻土N₂O累计释放量随着土壤水分含量的增加而增加，且干湿交替会进一步促进N₂O释放。土壤在60% WHC时的N₂O释放量最小，可能是由于湿度低，微生物活性低，土壤脱氮率低，土壤有机碳和无机氮扩散弱^[25]；同时，60% WHC处理的NH₄ ⁺ 消耗量与NO₃⁻生成量高于100%和100% ~ 60% WHC处理，且净硝化速率最高，该条件下主要发生硝化反应，反硝化反应弱，导致N₂O释放偏低。100% WHC处理中的N₂O累计释放量高于60% WHC处理，同时100% ~ 60% WHC处理中的N₂O累计释放主要集中在100% WHC阶段，表明培养时期内黄棕壤性水稻土主要在100% WHC阶段释放N₂O。这与前人研究结果一致，Bollmann^[26]发现较高的土壤含水量有利于通过反硝化释放N₂O，低于80% WHC主要由硝化释放N₂O。Ma等^[7]通过将潮土从干旱到再湿润的试验，区分不同时期N₂O的释放，发现在恒定土壤水分条件下，90% WHC土壤N₂O总释放量显著高于30%WHC、45%WHC、60%WHC和75% WHC处理。100% ~ 60% WHC处理中的N₂O累计释放量高于60%WHC和100% WHC处理，表明干湿交替会增加黄棕壤性水稻土N₂O的释放。这是因为在100%WHC和100% ~ 60% WHC处理的amoA、nosZ和nirK基因拷贝数均高于60% WHC处理，土壤氨氧化和反硝化可能反应过程强烈，NO₃⁻大量被转化，N₂O的释放增多；60%WHC阶段时16S rDNA基因拷贝数低，主要发生硝化反应，土壤中的NH₄ ⁺ 转化为NO₃⁻，未被利用导致NO₃⁻大量累积，为下一阶段的反硝化过程提供了更多的底物。

培养时期内，水钠锰矿提高了60%WHC和100% WHC处理的N₂O释放量，与前人的研究结果一致，邢志强等^[12]通过在红壤性水稻土中添加不同质量百分比的水钠锰矿，发现水钠锰矿提高了土壤N₂O释放速率，增加了土壤N₂O累积释放量。不同的是在100% ~ 60% WHC处理中，水钠锰矿对N₂O的释放并无显著影响。这可能是因为水钠锰矿对黄棕壤性水稻土的影响可能是生物与非生物耦合产生。60% WHC条件下水钠锰矿可能显著提高了土壤反硝化微生物驱动的N₂O释放，从而促进了60% WHC条件下黄棕壤性水稻土N₂O的释放。而随着含水量的升高，黄棕壤性水稻土的反硝化微生物驱动的N₂O释放可能减少，但N₂O的释放量增多，这可能是因为高含水量下，土壤中氧化还原反应增强，生物与非生物的耦合过程增多，非生物N₂O的释放增强。同时，100% WHC处理水钠锰矿大幅降低了土壤16S rDNA基因拷贝数，水钠锰矿会对微生物产生毒害从而抑制其活性，改变土壤的细菌群落结构^[27]，进而可能影响水钠锰矿对黄棕壤性水稻土的生物与非生物耦合作用。

水钠锰矿在土壤中很可能显著提高了恒定水分处理中的土壤反硝化微生物驱动的N₂O释放，却显著降低了干湿交替水分处理中的土壤反硝化微生物驱动的N₂O释放，这可能是因为在黄棕壤性水稻土中，含水量的升高和降低极有可能改变了水钠锰矿的形态，干湿交替的水分条件下水钠锰矿发生氧化还原，Mn^{2 +} 变化强烈。土壤N₂O的释放主要集中在前3 d，添加水钠锰矿的处理中Mn^{2 +} 的浓度显著高于没有添加水钠锰矿的处理，这可能是因为水钠锰矿被还原提高了土壤Mn^{2 +} 的浓度，从而促进了培养前3 d土壤N₂O的释放。水钠锰矿可能与氨氧化过程产生的NH₂OH反应生成N₂O，促进黄棕壤性水稻土N₂O的释放。在热力学上，存在锰氧化物能够通过氧化NH₂OH产生N₂O，即：2NH₂OH + 2MnO₂ + 4H ⁺ →N₂O + 2Mn^{2 +} + 5H₂O^[28]。Zhang等^[29]发现锰氧化物被还原为Mn^{2 +} ，形成氨氧自由基作为NH₂OH氧化的产物。随着培养时间的延长，干湿交替处理对土壤Mn^{2 +} 的影响显著，但干湿交替时水钠锰矿对N₂O释放的促进效应明显被抑制，这可能是干湿交替中还原后的Mn^{2 +} 能够与NO₃⁻反应产生N₂^[30]，促进反硝化过程，从而导致干湿交替条件下水钠锰矿并没有显著促进土壤N₂O的释放。水钠锰矿在土壤中受干湿交替的水分影响不停地发生氧化还原反应，极有可能参与非生物反硝化过程。水钠锰矿参与的非生物反硝化过程可能在黄棕壤性水稻土N₂O的释放中发挥了不可忽视的作用。

当黄棕壤性水稻田淹水时，主要发生反硝化过程，微生物活性可能增强；土壤中的水钠锰矿具有强氧化性，能够直接与NH₄ ⁺ 反应生成NO₃^-[31]，为反硝化过程提供更多的底物，同时，水钠锰矿能够提高土壤反硝化微生物驱动的N₂O释放，生物与非生物的硝化耦合反硝化产生N₂O过程强烈，导致土壤N₂O释放增多。干燥时，主要发生硝化过程，微生物活性减弱，累积大量NO₃⁻；上一过程产生的还原态锰能够转化为氧化态锰^[32]，为下一阶段兼性厌氧环境中的反硝化提供了大量反应底物。交替进行应使黄棕壤性水稻田N₂O释放增多，但干湿交替降低了水钠锰矿对黄棕壤性水稻土N₂O释放的促进效应从而导致干湿交替下添加水钠锰矿并未促进黄棕壤性水稻N₂O的释放。干湿交替的水分条件下生物与非生物硝化耦合反硝化频繁发生，可能是水稻土N₂O释放的重要原因。土壤中的铁氧化物易发生氧化还原变化，其氧化和还原过程可能会耦合土壤氮素的转化，进而影响土壤N₂O的释放^[33]，可以结合¹⁵N和¹⁶O双同位素示踪技术，探明氨氧化微生物、铁锰氧化物和反硝化微生物对不同土壤N₂O释放的耦合机制。

4.   结论

培养时期内，随着含水量升高黄棕壤性水稻土N₂O的释放增加，干湿交替会导致更强的N₂O的释放。在恒定水分条件下，水钠锰矿（0.1%，w/w）显著促进了黄棕壤性水稻土N₂O释放；但在干湿交替水分条件下，水钠锰矿对N₂O释放影响不显著，干湿交替降低了水钠锰矿对黄棕壤性水稻土N₂O释放的促进效应。